Tematy badawcze

Wpływ oddziaływań komórka-komórka na aktywność migracyjną komórek nowotworowych


Zdolność komórek zwierzęcych do aktywnej migracji obserwowana jest w czasie takich procesów jak rozwój embrionalny, reakcje obronne układu odpornościowego i procesy gojenia się ran. Nabycie zdolności do niekontrolowanej przez organizm migracji jest również jedną z podstawowych właściwości umożliwiających nowotworom złośliwym naciekanie sąsiednich tkanek oraz tworzenie odległych przerzutów, przyczyniając się w stopniu daleko wyższym niż sam niekontrolowany wzrost do śmiertelności pacjentów obarczonych chorobą nowotworową. Wiele badań wskazuje na istnienie korelacji pomiędzy aktywnością ruchową komórek nowotworowych, a ich zdolnością do tworzenia przerzutów. Migracja komórek nowotworowych w trakcie tworzenia przerzutów nie jest procesem przypadkowym. Na kierunek migracji oraz aktywność ruchową komórek nowotworowych wpływa wiele czynników zewnętrznych, których źródłem są prawidłowe komórki organizmu, w którym rozwija się nowotwór, lub same komórki nowotworowe. Do najbardziej znanych typów reakcji kierunkowych komórek zaliczamy: chemotaksję, haptotaksję, elektrotaksję i naprowadzanie przez kontakt. Osobną grupę czynników mających wpływ na migrację komórek nowotworowych w czasie tworzenia przerzutów stanowią bezpośrednie oddziaływania komórka-komórka. Większość komórek inwazyjnych charakteryzuje się brakiem lub ograniczeniem kontaktowego zahamowania migracji i może w większym lub mniejszym stopniu migrować po powierzchni innych komórek zarówno prawidłowych jak i nowotworowych. Bezpośrednie kontakty z innymi komórkami mogą zwiększać aktywność ruchową komórek nowotworowych i ich zdolność do wydajnego przemieszczania się. Jednym z tematów badawczych realizowanych w Zakładzie są badania mechanizmów kontaktowej stymulacji migracji komórek nowotworowych (więcej o temacie link do publikacji).

Rola reduktazy tioredoksyny w regulacji aktywności ruchowej komórek

Reaktywne formy tlenu (ROS) oprócz szkodliwego wpływu na komórki są również ważnym czynnikiem związanym z przesyłaniem sygnału w komórce. Rola ROS w tych procesach polega głównie na regulacji aktywności białek enzymatycznych, w szczególności fosfataz i kinaz białkowych, na drodze ich odwracalnego utleniania. Modyfikacja aktywności białek w wyniku utleniania wymaga również istnienia mechanizmu przeciwnego, powodującego powrót regulowanych białek do stanu wyjściowego. Jednym z postulowanych układów enzymatycznych odpowiedzialnych za ten proces jest układ tioredoksyny. Tioredoksyna jest małym peptydem o masie cząsteczkowej 12 kDa. Tioredoksyny mogą redukować mostki disulfidowe białek, same ulegając przy tym utlenieniu. Reaktywacja tioredoksyny następuje w wyniku działania reduktazy tioredoksyny. Układ tioredoksyny oprócz ochrony białek przed stresem oksydacyjnym, jest również zaangażowany w szereg specyficznych funkcji związanych z regulacją redoks wielu kluczowych dla przesyłania sygnału w komórce białek, np. kinazy ASK-1, fosfatazy tyrozynowej PTP1B i serynowo-treoninowej PP2B, białkowej kinazy C. Jednym z tematów badawczych realizowanych w Zakładzie są badania znaczenia reduktazy tioredoksyny w procesach regulacji aktywności ruchowej komórek, struktury cytoszkieletu aktynowego i komunikacji międzykomórkowej przez złącza szczelinowe (więcej o temacie link do publikacji).

Komunikacja międzykomórkowa w etiopatogenezie choroby nowotworowej

Elementy kompleksu powierzchniowego, na który składają się receptory macierzy zewnątrzkomórkowej i adhezji międzykomórkowej wraz z systemem białek zaangażowanych w interakcje z cytoszkieletem decydują o integralności mechanicznej wielu tkanek. Zostały one również zidentyfikowane jako czynniki zaangażowane w transformację nowotworową i rozwój nowotworów. Jednak znaczenie bezpośredniego transferu metabolitów za pośrednictwem złącz szczelinowych (koneksonów) w etiopatogenezie nowotworów pozostaje niejasne. W początkowych etapach karcinogenezy zanik międzykomórkowego transferu metabolitów między komórkami neoplastycznymi osłabiać może efektywność tkankowych systemów regulujących wzrost komórek a tym samym promować transformację nowotworową. Z drugiej strony stwierdzono ostatnio, że niektóre typy komórek nowotworowych o wysokim potencjale metastatycznym charakteryzują się wysokim poziomem międzykomórkowego transferu metabolitów za pośrednictwem złącz szczelinowych. W Zakładzie prowadzone są badania funkcji kompleksu powierzchniowego złożonego z receptorów adhezji komórka-macierz zewnątrzkomórkowa (np. integryn), adhezji międzykomórkowej (np. kadheryn) i złącz szczelinowych (zbudowanych z koneksyn) w toku progresji nowotworu i jego potencjalnego udziału w tworzeniu przerzutów przez komórki nowotworowe (więcej o temacie link do publikacji).

Inżynieria tkankowa – biotechnologia medyczna – komórki macierzyste

Inżynieria tkankowa stanowi alternatywę dla konwencjonalnych metod leczenia ubytków tkanek wywołanych urazami lub chorobą nowotworową. Jej istota opiera się na wykorzystaniu hodowanych poza organizmem komórek ludzkich na nośniku, który imituje macierz pozakomórkową, typową dla danej tkanki. Ta dziedzina biotechnologii rozwija się już od ponad 20 lat, a stało się to możliwe dzięki opanowaniu metod izolacji i hodowli populacji komórek, wzbogaconych w komórki macierzyste, odpowiadających za regenerację tkanek.
Optymalizacja izolacji i hodowli tych komórek z zachowaniem ich „niedojrzałego" fenotypu i wysokiego potencjału proliferacyjnego to cel badań wielu pracowni na świecie. Wiąże się to z badaniem biologii tych komórek, której poznanie i zrozumienie pozwoli na sterowanie procesami ich różnicowania i starzenia.

W ostatnich latach powszechne stało się kliniczne wykorzystanie hodowanych in vitro keratynocytów w przypadkach gdy zawodzą naturalne mechanizmy naprawy. Przeszczepy hodowanych in vitro keratynocytów stosuje się przede wszystkim w leczeniu rozległych oparzeń oraz chronicznych owrzodzeń. Zapewniają one szybkie i trwałe zabezpieczenie rany, długotrwałą skuteczność oraz dobry efekt kosmetyczny, związany ze znacznym zmniejszeniem procesu kurczenia się rany pod przeszczepem i brakiem powstawania blizn.

Tempo i jakość odtwarzającego się naskórka zależy od ilości komórek macierzystych jaka znalazła się pośród komórek przeszczepionych pacjentowi. Tylko te bowiem mogą zapewnić trwałą odbudowę uszkodzonego naskórka. Uzyskanie hodowli wzbogaconych w komórki macierzyste w znaczny sposób może poprawić skuteczność stosowanych przeszczepów. Pracownia Inżynierii Komórkowej i Tkankowej specjalizuje się w hodowli autologicznych komórek skóry ludzkiej, które wykorzystywane są w leczeniu oparzeń oraz trudno gojących się ran (więcej o temacie link do publikacji).

Siódmego października 2011 dr Justyna Drukała udzieliła widzom programu TVP „Kawa czy herbata", wywiadu na temat hodowli komórek skóry, prowadzonych w Pracowni Inżynierii Komórkowej i Tkankowej ZBK. Fragmenty można zobaczyć na stronie TVP http://www.tvp.pl/styl-zycia/magazyny-sniadaniowe/kawa-czy-herbata/wideo/hodowle-komorek-skory/5420437

Różnicowanie fibroblastów w miofibroblasty w procesach patologicznych

Astma oskrzelowa jest obecnie jedną z najczęstszych chorób dróg oddechowych i dotyka około 10% populacji ludzkiej. Zapaleniu występującemu w drogach oddechowych towarzyszą procesy uszkadzania i naprawy nabłonka oskrzeli, które powodują strukturalne i czynnościowe zmiany określane jako przebudowa ściany oskrzeli (ang. remodeling). Mimo intensywnych badań, w dalszym ciągu nie wiadomo, czy przebudowa oskrzeli jest tylko skutkiem przewlekłego zapalenia błony śluzowej, czy też jedną z przyczyn choroby. Cechą charakterystyczną oskrzeli osób chorych na astmę jest odkładanie składników macierzy pozakomórkowej bezpośrednio pod błoną podstawną, oraz pojawianie się dużej liczby miofibroblastów (komórek o fenotypie pośrednim między fibroblastami, a komórkami mięśni gładkich) w przylegającej warstwie siateczkowatej, co prowadzi do usztywnienia ściany oskrzeli. Według hipotezy Holgate'a i wsp. komórki nabłonkowe i fibroblasty błony śluzowej oskrzeli tworzą czynnościową „troficzną jednostkę epitelialno-mezynchymalną". Zgodnie z tą hipotezą, uraz nabłonka prowadzi do zwiększonego uwalniania mediatorów, które aktywują przemianę fibroblastów do miofibroblastów oraz zwiększają ekspresję i wydzielanie przez nie białek macierzy zewnątrzkomórkowej. Prowadzone w Zakładzie badania, wykorzystujące izolowane fibroblasty oskrzelowe poddawane działaniu różnych mediatorów pochodzenia epitelialnego, mają na celu wyjaśnienie roli nabłonka w remodelingu oskrzelowym. Zrozumienie procesu przebudowy oskrzeli może w przyszłości umożliwić podjęcie prób jego odwrócenia lub zahamowania przy użyciu nowych leków.

Optymalizacja wykorzystania wybranych populacji komórek macierzystych w kardiologii eksperymentalnej

W ciągu ostatnich kilkunastu lat komórki macierzyste (KM) stały się przedmiotem licznych, prowadzonych na całym świecie badań, dając realne nadzieje na ich zastosowanie w medycynie regeneracyjnej, w tym w kardiologii eksperymentalnej.
Badania prowadzone w Zakładzie Biologii Komórki wpisują się również w tę tematykę i obejmują m.in. optymalizację izolacji oraz hodowli różnych populacji KM i progenitorowych w celu ich zastosowania w regeneracji tkanek uszkodzonych w wyniku niedotlenienia. Komórki wykorzystywane w badaniach pozyskiwane są z kilku ważnych źródeł i obejmują m.in. KM szpiku kostnego, krwi pępowinowej i galarety Whartona oraz inne tkanki, takie jak mięsień sercowy. Z wymienionych źródeł w naszym Zakładzie pozyskujemy m.in. zwierzęce oraz ludzkie komórki macierzyste mezenchymalne (MSCs; ang. Mesenchymal Stem Cells), komórki progenitorowe śródbłonka (EPCs; z ang. Endothelial Progenitor Cells); komórki VSELs (z ang. Very Small Embryonic-Like stem cells) oraz endogenne komórki progenitorowe serca (CSCs; z ang. Cardiac Stem Cells). Niezależnie od KM pozyskiwanych z w/w naturalnych rezerwuarów tkankowych, dzięki zastosowaniu reprogramowania genetycznego udało się również w naszym laboratorium wyprowadzić mysie oraz ludzkie klony pluripotencjalnych komórek iPS (z ang. induced Pluripotent Stem cells).
Z naszych dotychczasowych badań przeprowadzonych we współpracy z ośrodkami w USA (Institute of Molecular Cardiology University of Louisville oraz Cardiovascular Research Institute University of Kansas) wynika, że adherentna subpopulacja komórek MSCs szpiku kostnego o fenotypie niehematopoetycznym (CD45neg) oraz wykazująca ekspresję antygenów komórek prymitywnych oraz mezenchymalnych (m.in. Sca-1, CD90), ale nie wykazująca ekspresji antygenu CD105 (CD105neg) charakteryzuje się zwiększonym potencjałem angiogennym oraz kardiomiogennym w porównaniu z pełną frakcją szpikowych MSCs. Wyniki te stały się m.in. podstawą patentu (US 8,431,162 B2) oraz pozyskania grantu badawczego z NCN.
Podjęte badania mają na celu wyselekcjonowanie wśród heterogennej populacji komórek MSC, frakcji predysponowanej w kierunku różnicowania do komórek śródbłonkowych oraz kardiomiocytów, co potencjalnie zwiększy ich potencjał regeneracyjny po przeszczepie do mięśnia sercowego. Obecnie w naszym Zakładzie prowadzone są badania mające na celu zastosowanie komórek macierzystych pluripotencjalnych pozyskiwanych z tkanek dojrzałych – VSELs oraz indukowanych KM pluripotencjalnych –iPS, dla szeroko pojętych celów kardiologii eksperymentalnej (http://www.stemcells-project.eu/).
Badany jest także potencjalny udział efektów parakrynnych, w tym mikrofragmentów (MVs, z ang. Microvesicles) produkowanych przez KM i progenitorowe w regeneracji tkanek. Badania te prowadzone są w ramach projektu TEAM finansowanego przez FNP.

Optymalizacja metod identyfikacji oraz izolacji różnych populacji komórek macierzystych i progenitorowych dla celów medycyny regeneracyjnej

Optymalizacja metod identyfikacji oraz izolacji różnych populacji komórek macierzystych oraz progenitorowych stanowi ważny aspekt przygotowania tych komórek dla dalszych celów badawczych oraz potencjalnych zastosowań przedklinicznych i klinicznych dla celów medycyny regeneracyjnej.
Z tego względu badania mające na celu identyfikację subpopulacji KM o różnych właściwościach na podstawie ich charakterystycznego profilu antygenowego, prowadzone są w Zakładzie Biologii Komórki nie tylko z zastosowaniem metod cytometrii przepływowej klasycznej oraz cytometrii obrazowej (ImageStream), ale także analiz na poziomie genomu i proteomu komórki (mRNA, miRNA, białka). Do izolacji KM i progenitorowych wykorzystywane są zarówno techniki sortowania immunomagnetycznego (MACS, z ang. Magnetic-Activated Cell Sorting) oraz wieloparametrowego sortowania opartego o fluorescencję (FACS; z ang. Fluorescence-Activated Cell Sorting).
Obecnie w Zakładzie prowadzone są badania mające na celu opracowanie optymalnych metod pozyskiwania oraz namnażania m.in. komórek ze szpiku kostnego i krwi pępowinowej (MSCs, VSELs), subpopulacji tkankowo-specyficznych komórek progenitorowych (EPCs, CSCs) oraz komórek iPS.
Dzięki współpracy z ośrodkami naukowymi w USA – Stem Cell Institute University of Louisville, KY oraz Cardiovascular Research Institute University of Kansas – z zastosowaniem nowoczesnych technik wielokolorowej cytometrii przepływowej oraz obrazowej (ImageStream), udało się opracować unikatowe procedury izolacji komórek VSELs oraz MSCs (US PA No: 20100267107 oraz 20090155225; link: http://www.faqs.org/patents/app/20100267107; http://www.faqs.org/patents/app/20090155225.
W Zakładzie prowadzone są także rutynowo eksperymenty obejmujące namnażanie wektorów wirusowych (służących m.in. do reprogramowania KM) oraz pozyskiwanie ludzkich oraz mysich komórek pluripotencjalnych iPS. Hodowle i ekspansje tych komórek prowadzone są w wystandaryzowanych warunkach: „feeder-layer free" oraz „serum free", co pozwala na uzyskanie czystej kultury tych komórek dla celów transplantacyjnych.
W celu badań nad efektami parakrynnymi użytecznymi w regeneracji tkanek opracowano również metody pozyskiwania oraz zagęszczania frakcji mikrofragmentów (MVs) wydzielanych przez KM. Fenotyp oraz potencjał regeneracyjny pozyskanych MVs po przeszczepieniu do tkanek ischemicznych jest obecnie intensywnie badany w naszym zespole.