Wykorzystanie metod immunocytochemicznych  w diagnostyce medycznej

PRAKTIKUM Z BIOLOGII KOMÓRKI
(BT 206, BT 231)

Wykorzystanie metod immunocytochemicznych w diagnostyce medycznej

Immunocytochemia zajmuje się wykrywaniem i lokalizacją w komórkach (czy też w szerszym rozumieniu w tkankach) substancji o charakterze antygenowym, za pomocą znakowanych przeciwciał. U podstaw metod immunnocytochemicznych leży zjawisko wiązania antygenu przez swoiste i charakterystyczne przeciwciała. Takie wiązanie cechuje wysoka specyficzność, ponieważ cząsteczka przeciwciała rozpoznaje i wiąże antygen (zazwyczaj białko lub jego fragment) o ściśle określonej konfiguracji przestrzennej.

Najczęściej stosowanym typem metod immunocytochemicznych są metody pośrednie, które  polegają  ona  na  stosowaniu  nieznakowanego
pierwszorzędowego przeciwciała wykrywającego interesujący badacza antygen, a w następnej kolejności przeciwciała drugorzędowego, które jest znakowane odpowiednim  znacznikiem  umożliwiającym wizualizację poszukiwanego kompleksu antygen- przeciwciało. Najczęściej stosowanymi znacznikami w tych metodach są fluorochromy lub enzymy. Znacznikami przeciwciał używanych do wykrywania antygenów w preparatach do mikroskopii elektronowej

są  białka  zawierające  metal  ciężki  (ferrytyna)  lub metale ciężkie (zazwyczaj złoto koloidalne).

Schemat metody immunocytofluorescencji pośredniej

Obecnie metody immunocytochemii pośredniej stosuje się na szeroką skalę nie tylko w badaniach podstawowych biologii komórki, biochemii, biologii molekularnej (do wykrywania składników komórek, badania ich funkcji, poznawania procesów zachodzących komórkach w stanach fizjologicznych i patologicznych organizmu), ale także w medycynie i diagnostyce medycznej. Z ich pomocą można m.in. prowadzić diagnostykę obecności wielu wirusów  (np.  HIV,  WZW),  diagnostykę  chorób  tarczycy,  ciąży  i  płodności,  uszkodzeń mięśnia sercowego, niedokrwistości, wielu wrodzonych chorób genetycznych i chorób metabolicznych. Metody immunocytochemiczne używane są również w toksykologii i transplantologii.  Dla  wielu  w  w/w  jednostek  chorobowych  scharakteryzowano i  opisano szereg markerów (do których należą białka pełniące w komórkach różnorodne funkcje, zarówno białka strukturalne jak i funkcjonalne, np. enzymy, hormony, białka receptorowe), których detekcja w badanym materiale stanowi podstawę diagnozy medycznej.

Metody  immunocytochemiczne są  również  bardzo  często  wykorzystywane  w diagnostyce nowotworów - określanie typu oraz stopnia zróżnicowania nowotworu – cech bardzo    ważnych    z    punktu    widzenia    prognostyki    i    wyboru    metod    leczenia. Jednymi z ważniejszych markerów oceny procesu nowotworzenia oraz rozsiewania komórek nowotworowych w organizmie (przerzuty nowotworowe) są białka budujące filamenty pośrednie. Filamenty pośrednie (FP) to elementy cytoszkieletu stabilizujące komórki i tkanki zwierzęce,    a     także     determinujące lokalizację poszczególnych struktur wewnątrzkomórkowych. FP są zbudowane z wielu (specyficznych tkankowo) skręconych razem białek włóknistych i charakteryzują się dużą wytrzymałością zarówno na stres mechaniczny (zgniatanie, rozciąganie) jak i na działanie substancji chemicznych. Białka FP składają się z globularnej głowy na N-końcu łańcucha polipeptydowego, globularnego ogona

na C-końcu i domeny środkowej, która posiada charakter helisy α, umożliwiający dwóm filamentom owinąć się wokół siebie w strukturę superhelisy. Monomery białek FP łączą się ze sobą w dimery dzięki strukturze domeny środkowej, a dwa dimery zestawiają się tworząc dachówkowato  ułożony  tetrametr.  Tetramery  łączą  się  wiązaniami  niekowalencyjnymi (koniec do końca i bok do boku) i tworzą ostatecznie helikalne, linopodobne FP. Obecnie, na

podstawie homologii sekwencji aminokwasowej domen centralnych oraz struktury drugorzędowej białek, wyróżnia się sześć klas (typów) białek FP:

Typ I - kwaśne keratyny - w nabłonkach,
Typ II - obojętne/zasadowe keratyny - w nabłonkach, Typ III – wimentyny i białka wimentynopodobne:
•	wimentyny - w komórkach mezenchymalnych,
•	desminy - w komórkach mięśniowych,
•	GFP (glejowe białka włókienkowe) - w komórkach glejowych,
Typ IV - białka neurowłókienkowe - w neuronach,
Typ	V	–	laminy	(grupa	niespecyficzna)	–	białka	otoczki	jądrowej we wszystkich komórkach jądrzastych,
Typ VI - nestyna - w komórkach endodermalnych.

W zasadzie każdy typ filamentów pośrednich cytoplazmatycznych jest charakterystyczny dla danej tkanki. Tę właściwość filamentów pośrednich wykorzystuje się przy lokalizacji przerzutów nowotworów. Oznaczając markery specyficzne tkankowo, m. in. białka   filamentów   pośrednich   można   wykryć   obecność   komórek   nowotworowych   w wycinkach tkankowych, a także oszacować pochodzenie danego nowotworu.

Cel ćwiczenia:

Wykorzystanie metod immunocytochemii pośredniej do identyfikacji komórek nowotworowych w kokulturach z komórkami prawidłowymi w hodowli in vitro (imitacja skrawków tkankowych z przerzutami komórek nowotworowych).

Przebieg ćwiczenia:

I.	Identyfikacja filamentów pośrednich: cytokeratynowych i wimentynowych, w otrzymanych komórkach metodą pośredniej immunofluorescencji.
II.	Identyfikacja filamentów cytokeratynowych w otrzymanych komórkach pośrednią metodą immunoenzymatyczną.
III.	Porównanie przydatności  obu metod do wykrywania takiego samego antygenu
(cytokeratyny)
IV.	Oglądanie preparatów immunohistochemicznych z diagnostyki nowotworów w tkankach miękkich (wykrywanie antygenów nowotworowych)

Wykonanie ćwiczenia:

 P raca  w  dwuosobowych  zespołach 

1.   Oglądnąć (w mikroskopie odwróconym) komórki wysiane na szkiełkach umieszczonych w
szalkach hodowlanych. Mogą to być:
mysie fibroblasty 3T3 (imitacja prawidłowej tkanki łącznej)
mysie fibroblasty 3T3 w kokulturze z mysimi komórkami rakowymi np. trzustki, płuc lub
jelita
(imitacja prawidłowej tkanki łącznej z przerzutami nowotworowymi)

2.  Każdy zespół wybiera do barwienia 3 szalki ze szkiełkami z takimi samymi komórkami (szkiełka tylko komórkami prawidłowymi lub kokulturą komórek prawidłowych i nowotworowych).

3.  Szkiełka należy wykorzystać do identyfikacji filamentów pośrednich: cytokeratynowych i wimentynowych oraz czynnika transkrypcyjnego Snail-1 metodą pośredniej immunofluorescencji dwa szkiełko należy przeznaczyć do wykrywania poszukiwanego białka metodą immunocytofluorescencji pośredniej (inkubacja utrwalonych komórek kolejno z pierwszo- i drugorzędowymi przeciwciałami), trzecie szkiełko wykorzystać do przeprowadzenia kontroli negatywnej (inkubacja utrwalonych komórek tylko z drugorzędowymi, znakowanym fluorescencyjnie przeciwciałami)

I.	Identyfikacja filamentów pośrednich: cytokeratynowych i wimentynowych oraz białka Snail-1 w otrzymanych komórkach metodą pośredniej immunofluorescencji.

1.	Wybrać (każdy zespół) do barwienia 2 szkiełka z takimi samymi komórkami.

2.	Zlać pożywkę z szalki znad szkiełek z komórkami i przepłukać dokładnie szkiełka roztworem
PBS z jonami Ca2+,Mg2+ o temp. 37°C.

3.	Zlać PBS i zalać komórki 3,7% roztworem formaldehydu w PBS o temp.37°C i utrwalać komórki przez 15 min w cieplarce.

4.	Zlać utrwalacz znad komórek i przepłukać szkiełka 2 razy roztworem PBS.

5.	Zlać PBS i zalać komórki 0.1% roztworem Tritonu X-100 i pozostawić na 7 min w temperaturze pokojowej.

6.	Zlać Triton X-100 znad komórek i przepłukać szkiełka 3 razy PBS. Jedno szkiełko przeznaczyć do wykrywania poszukiwanego białka metodą immunocytofluorescencji pośredniej ( inkubacja komórek kolejno z pierwszo- i drugorzędowym przeciwciałem), drugie szkiełko z utrwalonymi komórkami pozostawićw PBS (inkubacja tylko z drugorzędowym przeciwciałem- kontrola)

7.	Zlać PBS i zalać komórki roztworem 3% BSA (albuminy surowicy wołowej) w PBS i
inkubować w temperaturze pokojowej około 15 min.

8.	Przygotować komory wilgotnościowe do barwienia komórek: Małe szalki szklane umieścić w dużych szalkach wyłożonych wilgotną watą (komory wilgotnościowe), aby krople przeciwciała nie wysychały.

9.	Inkubacja komórek z pierwszorzędowym przeciwciałem: Na suchą małą szalkę położyć 1 pasek parafilmu o wielkości około 2cm x 2cm, na środek każdego kawałka parafilmu nakropić
20μl pierwszego przeciwciała (przeciwciała otrzymane od asystenta – mieszaninia)
monoklonalne mysie przeciwciało przeciwko:
wimentynie – mysie IgM
cytokeratynie – mysie IgG
Snail-1 – królicze IgG

(Każdy zespół wykonuje barwienie cytokeratyny, wimentyny i Snail-1)

10.  Wyjąć szkiełko z utrwalonymi komórkami szalki z roztworu BSA w PBS, osuszyć brzegi szkiełka bibułą i położyć je na parafilmie, tak aby komórki dotykały kropli przeciwciała. Inkubować komórki z pierwszym przeciwciałem 45 min w temperaturze pokojowej.

11.  Po inkubacji komórek z przeciwciałem pierwszorzędowym szkiełko umieścić w szalce
wypełnionej roztworem PBS i przepłukać starannie 3 razy.

12.  Inkubacja komórek z przeciwciałem drugorzędowym znakowanym fluorescencyjnie i z barwnikami fluorescencyjnymi do wybarwienia jąder komórkowych: Na szalkę położyć dwa paski parafilmu o wielkości około 2cm x 2cm i na środek każdego nakropić 20μl mieszaniny barwników (mieszanina barwników otrzymana od asystenta), która zawiera odpowiednio rozcieńczone:
a) kozie przeciwciało anty-mysie IgG znakowane Alexa-488 b) przeciwciało anty-mysie IgM znakowane Alexa-546
c) przeciwciało anty-królicze IgG znakowane Alexa-405

13.  Barwione szkiełka z komórkami położyć kolejno na paskach parafilmu tak, aby komórki dotykały kropli mieszaniny barwników i barwić komórki 35 min, w ciemności, w temperaturze pokojowej, w szalkach wyłożonych wilgotną watą.

14.  Po zakończonym barwieniu zdjąć każde ze szkiełek z parafilmu i przenieść do szalek z H2O
destylowaną i wypłukać szkiełka starannie 5 razy.

15.  Wyczyścić szkiełko podstawowe i nakropić na nie 2 razy po 10μl H2O destylowanej. Na krople wody nałożyć kolejno szkiełka z wybarwionymi komórkami (komórkami do wody), osuszyć brzegi szkiełek bibułą i okleić je lakierem do paznokci.

16.  Tak przygotowane preparaty oglądnąć w mikroskopie fluorescencyjnym Leica DMI6000B. Dla struktur barwionych:
a) Alexa-Fluor 405
światło wzbudzające: UV (max 352nm), a emisja – światło niebieskie
b) Alexa-Fluor 488:
światło wzbudzenia: niebieskie (max 488 nm), a emisja – światło zielone
c)Alexa-Fluor 546:
światło wzbudzenia: zielone (max 546 nm), a emisja – światło czerwone

17.   Korzystając z pomocy asystenta wykonać zdjęcia 2D i 3D oraz przeprowadzić analizę mikrofluorometryczną. W tym celu:
- ustawić ostry obraz preparatu pod obiektywem immersyjnym 40x. Następnie przystąpić do ustawiania zakresu osi Z w jakim wykonane mają zostać zdjęcia. Skorzystać z proponowanych przez system ustawień rozdzielczości w osi Z oraz liczby skrawków optycznych i wykonać zdjęcia.  
- w zakładce „process- 3D projection” ustawić kąt rozpoczęcia projekcji jako ‑180 (parametr X) a zakończenia jako 180 (parametr Y). Metodę pozostawić jako „maximum”, scaling factor jako „1”, treshold „10”. Zaznaczyć opcję „create movie” i ustawić liczbę klatek jako 50. Następnie potwierdzić operację i obserwować wewnątrzkomórkową lokalizację badanych antygenów w projekcji 3D.
- wykonać analizę mikrofluorometryczną. W zakładace „quantify” uruchomić panel „graphs”. Na wykonanych zdjęciach zaznaczyć rejony, które chcemy analizować a następnie odczytać wartości fluorescencji w poszczególnych kanałach. Na tej podstawie wykazać różnice w poziomach ekspresji badanych białek pomiędzy poszczególnymi komórkami różnych typów. 

  	Na podstawie obserwacji komórek w wykonanych preparatach należy odpowiedzieć na pytania:

Czy otrzymane do barwienia komórki stanowiły populację heterogenną (hodowlę komórek prawidłowych i nowotworowych w kokulturze)?

Jeśli tak, to jaki procent populacji stanowią komórki nowotworowe (uwaga: należy skorzystać
z dodatkowego  barwienia jąder komórkowych)?

Temat referatu:

Wykorzystanie metod immunocytochemicznych w diagnostyce medycznej

Zagadnienia:

Typy tkanek ssaków i współdziałanie komórek w tkankach.
Przyczyny i mechanizmy powstawania i rozprzestrzeniania nowotworów (przerzuty). Specyficzność tkankowa filamentów pośrednich w komórkach.
Metody immunocytochemiczne w diagnostyce nowotworów.

Zalecana literatura:

B. Alberts i inni. – Podstawy Biologii Komórki, PWN 2005; rozdz. 21. B. Alberts et al. –
Molecular biology of the cell; 5th edition
Red. M. Zabel – Immunocytochemia, PWN 1999.
Red. I. Kątnik-Prastowska – Immunochemia w biologii medycznej, PWN 2009.