Mikroskopia Fluorescencyjna

Mikroskopia fluorescencyjna jest odmianą mikroskopii świetlnej, która, ze względu na duże możliwości identyfikacji struktur sub-komórkowych, znalazła szerokie zastosowanie w naukach biologicznych, w tym w biologii komórki, cytofizjologii, lecz również genetyce, biochemii, biofizyce i biotechnologii. Działanie nowoczesnych mikroskopów fluorescencyjnych oparte jest na epifluorescenyjnym systemie optycznym, umożliwiającym detekcję i wizualizację sygnału pochodzącego od fluorochromu, tj. substancji zdolnej do emisji światła fluorescencyjnego po wzbudzeniu światłem o określonej długości. W układzie tym, światło wzbudzające fluorescencję próbki kierowane jest, poprzez system filtrów i luster, do wysokoaperturowego obiektywu, a następnie skupiane na preparacie. Wzbudzone światło fluorescencyjne wraca do obiektywu, a następnie kierowane jest do detektora obrazu, którym może być np. oko ludzkie, fotopowielacz lub kamera CCD. Fluorochromy zawarte w analizowanych próbkach mogą być pochodzenia naturalnego (np. celuloza, chlorofil), jak również mogą być sztucznie wprowadzane do preparatów celem specyficznej wizualizacji określonych struktur sub-komórkowych lub niektórych procesów fizjologicznych. W tym drugim przypadku, wykorzystuje się m.in.:

  • fluorofory wykazujące powinowactwo do określonych organelli (np. DiI wiąże się specyficznie z błonami komórkowymi),
  • fluorofory, których właściwości fluorescenycjne zależą od parametrów mikrośrodowiska, np. jego pH, lub stężenia jonów wapnia (Fluo-4, Fura-2);
  • fluorofory sprzężone z substancjami wykazującymi specyficzne powinowactwo do określonych białek (np. rodamina sprzężona z falloidyną, toksyną Ammanita phalloides, łączącą się specyficznie z F-aktyną;
  • fluorofory koniugowane z przeciwciałami, bezpośrednio lub pośrednio wiążącymi się z określonymi antygenami;
  • białka fluorescencyjne;
  • fluorochromy zdolne do przenikania przez złącza szczelinowe determinujące komunikację międzykomórkową, np. kalceinę.

Ponadto, mikroskopia fluorescencyjna umożliwia zastosowanie szerokiego wachlarza analiz ilościowych, w tym fotometrii. Badania oparte na analizach pojedynczych komórek uzupełniane mogą być analizami ilości i wewnątrzkomórkowej lokalizacji wybranych struktur na poziomie białka (Western Blot) i mRNA (RT-PCR).